2.3蛋白质构象稳定性的结构分析

图1不同种类肉肌浆蛋白在不同时间点吸光度及构象速率的变化

对于阐述蛋白质表面疏水性与其乳化活性的关系方面已有大量研究支撑，但是在蛋白质构象特性与乳化活性关系方面却鲜有研究，这是因为蛋白质的结构会随着周围环境的变化而变化，导致蛋白质构象特性对其油-水界面性质的表征有很大难度。本实验主要利用盐酸胍诱导蛋白质变性，从而探究在不同处理时间下蛋白质构象的动态变化，盐酸胍的加入能破坏蛋白质的氢键、疏水键等，进而能破坏蛋白质的高级结构。而蛋白质在油-水界面的构象展开也可以被视为一种类似于部分“变性”的行为，因此盐酸胍诱导蛋白质结构展开是模拟蛋白质在油-水界面构象变化的良好手段，从而体现在油-水界面上的构象柔顺性，以及完成空间定位的难易程度，所以本研究对于揭示不同蛋白乳化特性差异有很重要的作用。

盐酸胍诱导肌浆蛋白变性的荧光光谱如图1A～C所示，3种肌浆蛋白都在290 nm波长处达到最大吸光度，由于酪氨酸主要对250～290 nm波长范围内具有吸收。由肌浆蛋白氨基酸组成可知，鸡肉肌浆蛋白的酪氨酸含量最高，这也解释了在第0分钟时鸡肉肌浆蛋白的吸光度相比较而言达到最大。而且猪肉和鱼肉肌浆蛋白在第120分钟时达到最大吸光度，这说明肌浆蛋白三级结构改变时，构象发生重排且构象展开，而鸡肉肌浆蛋白在第120分钟时吸光度有所下降，说明鸡肉肌浆蛋白结构改变较快。由图1D可知，随着时间的延长，构象变化速率越来越小，并且在相同时间下，猪肉肌浆蛋白与鸡肉肌浆蛋白的峰值变化速率无显著差异（P＞0.05），而鱼肉肌浆蛋白峰值变化速率相比较而言显著较慢（P＜0.05）。这一结果表明，和鱼肉肌浆蛋白相比，猪肉和鸡肉的肌浆蛋白构象柔顺性更好。

2.4肌浆蛋白界面吸附动力学分析

图2不同种类肉肌浆蛋白界面压力与吸附速率的变化

界面流变学提供了流体界面上分子吸附的重要信息。通过测定界面压力可以表征O/W界面的性质和表面活性物质的吸附和解吸附动力学性质，一般来说，油水界面蛋白质的吸附动力学过程包括以下几个重要步骤：首先蛋白质在界面上扩散形成一个次级界面区域；然后到达界面的蛋白质分子部分展开，界面张力下降；最后吸附的蛋白质分子在油-水界面发生结构重排。

越来越多的研究表明，界面流变性质极大影响着蛋白质的乳化性质，且两者关系紧密。在利用蛋白质制备乳液的过程中，蛋白质会吸附到油滴表面使得油水界面张力降低，所以张力是影响乳状液稳定性的一个主要因素。乳状液的形成必然使体系面积大大增加，也就是对体系要做功，从而增加了体系的界面能，这成为体系不稳定的来源，因此深入研究蛋白质的油-水界面性质对于揭示分散系的稳定机理有重要意义。本研究中，动态界面张力通过界面压力随吸附时间的变化表示，表面张力是由缓冲液的界面张力减去蛋白的界面张力所得。用直线的斜率表示扩散速率，柱状图即为吸附动力学特征参数。

从图2可以明显看出，随着吸附时间的延长，界面压力增大，表明蛋白质逐渐吸附到油-水界面，并且在最初的5 min内3种肌浆蛋白的界面压力快速增加。其中猪肉肌浆蛋白的界面压力在初期增长显著高于其他两种肌浆蛋白，这一现象的发生可能是由于猪肉肌浆蛋白的疏水性高于其他两者，根据Li Lingyun等的研究可知表面疏水性是影响蛋白质对界面油侧吸附的关键因素之一。此后3种肌浆蛋白界面压力值的增长趋缓，且鸡肉肌浆蛋白的界面压力始终大于其他两者，而猪肉肌浆蛋白界面压力最低。当吸附时间达到180 min后，界面压力趋于稳定，表明吸附基本达到平衡。在界面压力π值增加的起始阶段，界面上蛋白质浓度较低，吸附动力学受扩散作用的影响，遵循变形后的Ward和Tordai扩散模型所描述的π随吸附时间的变化，如下式所示：

式中：C0为初始浓度；K为波兹曼常数；T为绝对温度；D为扩散系数。

由图2可知，不同种类肌浆蛋白的动力学扩散速率间存在差异性。蛋白质分子在界面上的扩散速率受其粒径大小的影响，而本实验结果更能解释这一现象。在前述理化指标中，粒径大小为鸡肉肌浆蛋白＞猪肉肌浆蛋白＞鱼肉肌浆蛋白，而在本部分扩散速率大小为鸡肉肌浆蛋白＜猪肉肌浆蛋白＜鱼肉肌浆蛋白。这可能是由于大粒径的肌浆蛋白产生的空间位阻在一定程度上削弱了表面疏水性提高带来的吸附速率增加。而且鱼肉肌浆蛋白的扩散速率较猪肉和鸡肉肌浆蛋白间显著较大（P＜0.05），但鸡肉与猪肉肌浆蛋白之间的扩散速率却无显著性差异（P＞0.05）。

2.5肌浆蛋白乳化活性及乳化稳定性

图3不同种类肉肌浆蛋白乳化活性及乳化稳定性的差异

在前面的研究中得到，蛋白质的疏水性及粒径大小等会影响其油-水界面的性质，而蛋白质作为乳化剂其界面特性在它们形成和稳定乳液能力方面起着重要作用，进而影响蛋白质的乳化活性。油-水界面属于高能界面，未加乳化剂形成的乳化体系会很快崩溃，蛋白质是两性物质，既有疏水基团也有亲水基团，这样才使得蛋白质具有独特的乳化性能，且蛋白质表面疏水性越大，蛋白质所制得的乳液稳定性也会增强。对于不同肉类同种蛋白，表面特性和构象特性的差异会引起乳化活性和乳化稳定性的不同，如图3所示。鸡肉肌浆蛋白乳化活性最高，猪肉肌浆蛋白乳化活性稍低于鸡肉但无显著差异性（P＞0.05），但是鱼肉肌浆蛋白乳化活性显著低于猪肉和鸡肉肌浆蛋白（P＜0.05），这一结论与蛋白构象稳定性结果相符合。在盐酸胍诱导蛋白变性时，随时间的增加使其形成刚性结构，这正是导致鱼肉肌浆蛋白的峰值变化速率相比较猪肉和鸡肉而言差异性显著且其乳化活性较低的原因。鸡肉肌浆蛋白的稳定性相对于猪肉肌浆蛋白有所下降但差异性不显著，可能是因为鸡肉肌浆蛋白粒径相对最大，导致其形成乳液液滴变大，而一般来说乳液液滴越小越稳定，所以粒径可能是导致鸡肉肌浆蛋白稳定性变差的原因。而3种肌浆蛋白中鱼肉肌浆蛋白的乳化稳定性显著最差（P＜0.05），这可能与鱼肉肌浆蛋白的构象稳定性相对较差有关。

2.6不同种类肉肌浆蛋白各指标的主成分分析

图4不同种类肉肌浆蛋白主成分分析散点图（A）和载荷图（B）

由于测量指标间存在线性相关性，单一的指标不能更清楚地反映出不同种类肉肌浆蛋白间的差异性，因此进一步进行主成分分析。由图4A可知，第1主成分占59.31%，第2主成分占10.02%，总共占比69.33%，其中样本F10、F11以及F12对第1主成分贡献率较大，且与第1主成分呈正相关，而C7样本对第2主成分贡献率较大且呈正相关。由图4B可知，肌浆蛋白的扩散速率、溶解度、乳化活性、乳化稳定性、表面疏水性、电位、构象在30 min及60 min时的变化速率对第1主成分贡献率较大，其中扩散速率和溶解度与第1主成分呈正相关，而除此以外的其他指标与第1主成分呈负相关。而蛋白的构象在90 min以及120 min时的变化速率对第2主成分的贡献率较大。图中的乳化活性、表面疏水性、乳化稳定性及电位间距离较近，说明这些指标间存在一定的相关性。综合前述的研究结论可知肌浆蛋白的乳化活性和乳化稳定性与其表面疏水性、电位和构象变化速率有较强的相关性，而扩散速率与溶解度间相关性较强。

3结论

本实验以猪肉、鸡肉及鱼肉的肌浆蛋白为研究对象，通过测定其理化性质、氨基酸组成、蛋白质构象、界面性质以及乳化性质进而深入了解其油-水界面的性质。研究结果表明：不同种类肉的肌浆蛋白其理化性质、氨基酸组成、蛋白质构象、界面性质以及乳化性质都有一定的差异性。

肌浆蛋白中氨基酸组成、粒径和变性温度等都显著影响蛋白疏水性，其中鸡肉肌浆蛋白中酪氨酸和苯丙氨酸含量较高以致疏水性高于其他两种肌浆蛋白，而3种肉肌浆蛋白的粒径间无显著差异，但猪肉肌浆蛋白与鸡肉肌浆蛋白和鱼肉肌浆蛋白间有显著差异。

对于盐酸胍诱导的蛋白质构象稳定性，当肌浆蛋白三级结构改变时，构象发生重排且构象展开，鱼肉肌浆蛋白峰值变化速率相比较而言显著较慢，说明猪肉与和鸡肉的肌浆蛋白结构构象相对于鱼肉肌浆蛋白柔顺性更强。

肌浆蛋白的吸附动力学实验表明鱼肉肌浆蛋白的扩散速率较猪肉和鸡肉肌浆蛋白间显著较大，这可能是由于大粒径的肌浆蛋白产生的空间位阻在一定程度上削弱了表面疏水性的提高带来的吸附速率的增加，但鸡肉与猪肉肌浆蛋白之间的扩散速率却无显著性差异。

实验结果还表明，鸡肉肌浆蛋白乳化活性最高，鱼肉肌浆蛋白乳化活性显著低于猪肉和鸡肉肌浆蛋白，猪肉肌浆蛋白乳化活性稍低于鸡肉但无显著差异性，这可能是由于肌浆蛋白粒径及构象的不同造成的。但鱼肉肌浆蛋白的乳化稳定性显著最差。

本研究以分子间作用力及分子结构分析和界面流变研究作为有力工具，揭示肌浆蛋白纳米颗粒的界面吸附动力学规律。围绕这个中心可再进行深入研究，例如利用乳液替代食品中饱和脂肪的功能性食品等，利用肌浆蛋白纳米颗粒皮克林乳液调控脂肪消化，为功能性食品的开发提供理论依据。