摘要：通过单因素试验和响应面法优化了肥皂荚皂苷的水浸提工艺，分析了皂苷的表面活性性能，并对皂苷结构进行了初步表征，结果表明:肥皂荚皂苷水浸提的最佳工艺条件为2.0 g肥皂荚果皮粉末，提取温度69℃，提取时间11 h 15 min，液料比10∶1(mL∶g)，在此条件下，皂苷得率达26.49%。经过大孔吸附树脂纯化后得到60%乙醇洗脱皂苷和90%乙醇洗脱皂苷，其最低表面张力分别为47.43和35.83 mN/m，临界胶束浓度分别为0.35和0.75 g/L，皂苷中总糖分别为58.46%和51.16%。2种皂苷中单糖均为葡萄糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖等，但单糖含量略有差异。紫外和红外光谱分析表明:2种肥皂荚皂苷样品的紫外最大吸收波长均为470 nm左右，且均具有皂苷的基本红外特征。

肥皂荚(Gymnocladus chinensis)，为豆科肥皂荚属落叶乔木，广泛分布于中国各地如江苏、浙江、江西、安徽、福建、湖北、湖南等。肥皂荚果皮中含有丰富的皂苷，属于天然环境友好型的表面活性剂，目前仍没有得到充分开发利用。目前关于肥皂荚皂苷提取工艺的研究较少，仅有关于肥皂荚种皮中提取得到的皂苷结构的研究及其在药物方面应用的探究，具体表现为其在抑制酶活性和抗增殖活性等方面有一定的作用。皂苷的提取工艺主要有有机溶剂提取、超临界CO2提取和水浸提3种方式。有机溶剂提取不仅操作繁琐，而且污染环境；超临界CO2提取对设备要求较高，会增加提取成本；而水浸渍法提取皂苷具有操作简单、安全可靠、成本低和绿色环保等优点。因此，本研究以肥皂荚果皮为原料，采用水浸提的方法，在单因素试验基础上采用Box-Behnken响应面法优化肥皂荚皂苷的提取工艺；并对纯化后得到的皂苷进行性能分析和初步的结构表征，以期为肥皂荚资源的综合利用提供一定的理论依据。

1.材料与方法

1.1原料、试剂与仪器

肥皂荚果皮，采集于湖北省，干燥、粉粹、过筛，选取粒径≤0.250 mm部分，存放于干燥器中备用；香草醛、盐酸、氢氧化钠、无水乙醇、浓硫酸、α-萘酚、溴化钾、盐酸、石油醚(沸程60~90℃)，均为分析纯试剂(北京化工试剂厂)；AB-8型大孔吸附树脂；葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖，美国SIGMA公司；纯净水等。

UV-6100A紫外-可见分光光度计，上海比朗仪器有限公司；Bruker-ALPHA傅里叶变换红外光谱(FT-IR)仪，Bruker公司；Waters 2695高效液相色谱(配备Aminex HPX-87P柱子和2414 RID示差折光检测器)，Waters公司；Delta-8全自动高通量深夜黄色网站，芬兰Kibron公司。

1.2肥皂荚皂苷的提取

1.2.1工艺流程

准确称取2.0 g肥皂荚果皮粉末，按照一定液料比与蒸馏水混匀于具塞锥形瓶中，置于预设好的振动频率110 r/min的摇床中，在一定的温度下提取一定的时间，结束后将提取液放置于离心管中，4 000 r/min离心20 min，得到的上清液为粗皂苷水溶液。

1.2.2工艺优化

分别选取不同提取温度(25、35、45、55、65、75和85℃)、提取时间(8、12、16、20和24 h)、液料比(5:1、8:1、10:1、12:1、15:1和20:1，mL:g，下同)进行单因素试验，计算皂苷得率，比较不同条件对肥皂荚皂苷得率的影响。

在单因素试验基础上，采用Box-Behnken设计方案，以提取温度(A)、提取时间(B)和液料比(C)为考察因素，皂苷得率为响应值，利用Design-Expert 8.0.6软件优化肥皂荚皂苷提取工艺。

1.2.3皂苷得率的测定

参考香草醛-浓硫酸法使用自制的肥皂荚皂苷标准品作标准曲线。准确称量1.0 g自制肥皂荚皂苷标准品溶于水中，配置1 g/L的标准液。分别取标准液0.20、0.25、0.30、0.35和0.40 mL，置于10 mL具塞试管中，滴加去离子水至0.5 mL以配置成质量浓度分别为0.4、0.5、0.6、0.7和0.8 g/L的标准溶液，再滴加0.5 mL的80 g/L的香草醛溶液，于冰水浴中滴加4 mL的质量分数77%的浓硫酸，摇匀后置于60℃的恒温水浴锅中15 min，再移至冰水浴中放置10 min，在最大吸收波长470 nm下测定吸光度。以吸光度为纵坐标(Y)，标准品质量浓度为横坐标(X)制作标准曲线。得到线性回归方程为：Y=0.947 2X+0.000 6，相关系数R2=0.999 3。

取1.2.1节中得到的粗皂苷水溶液0.5 mL，分别加入0.5 mL的80 g/L的香草醛溶液和4 mL的质量分数77%的浓硫酸，摇匀后于60℃的水浴锅中反应15 min，再置于冰水浴中静置10 min，再在470 nm波长下测定样品溶液的吸光度，并根据标准曲线计算皂苷的质量浓度。根据下式计算皂苷得率(y)：

式中：C—粗皂苷水溶液中皂苷的质量浓度，g/L；V—粗皂苷溶液的体积，L；m—原料质量，g。

1.3肥皂荚皂苷的纯化

粗皂苷水溶液经旋转蒸发、真空干燥得到粗皂苷粉末。配置30 g/L的粗皂苷水溶液，通过已经处理好的大孔吸附树脂上样，吸附完成后，用水进行洗涤至无游离糖存在。前期研究表明AB-8大孔树脂对皂苷类化合物有较好的吸附性能，因此本研究采用AB-8树脂进行纯化。最后使用30%、60%和90%乙醇进行梯度洗脱，得到60%和90%乙醇洗脱这2种皂苷样品(30%的乙醇洗脱液中并未检测到皂苷的存在)。

1.4皂苷的性能表征

1.4.1表面张力的测定

取适量的干燥后的60%和90%乙醇洗脱的2种皂苷样品，配置成一系列浓度梯度的皂苷水溶液，在30℃下采用Delta-8全自动高通量深夜黄色网站测定各浓度样品的表面张力。

1.4.2临界胶束浓度的确定

根据1.4.1节得到的2种皂苷的表面张力，取浓度对数值为横坐标，表面张力为纵坐标，由图判断表面张力不再有明显下降所对应的最低浓度为临界胶束浓度。

1.5皂苷的结构表征

1.5.1紫外和红外光谱分析

将1.3节纯化得到的2种皂苷样品取适量配成水溶液，采用UV-6100A紫外-可见分光光度计，采用香草醛-浓硫酸法，在400~900 nm范围内进行紫外光谱扫描。采用Bruker-ALPHA傅里叶变换红外光谱仪，对绝干后的2种皂苷样品采用KBr压片法，在波数为400~4000 cm-1范围内进行扫描。

1.5.2高效液相色谱(HLPC)分析

将2种皂苷样品分别放入具塞耐压瓶中，加入适量1 mol/L稀盐酸，于100℃水解1 h。冷却至室温后用NaOH中和至pH值为3~4，4 000 r/min离心10 min。取上清液用0.22μm滤膜过滤，HPLC测定。采用美国国家可再生能源实验室标准方法测定皂苷样品中单糖成分，HPLC配置示差折光检测器(35℃)，在65℃条件下使用Aminex HPX-87H柱，流动相为0.5 mL/min的0.005 mol/L H2SO4。